Tet-On誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)是控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中目的基因定時(shí)表達(dá)的強(qiáng)大工具。Tet-On誘導(dǎo)型基因表達(dá)載體作用：當(dāng)不存在四環(huán)素及其類似物（如doxycycline）的情況下，目的基因幾乎或完全沉默；當(dāng)往體系中添加四環(huán)素或其他類似物（如doxycycline）時(shí)，目的基因得到快速高水平表達(dá)。 這是通過多組分系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，即四環(huán)素不存在的情況下，tTS蛋白使得基因沉默；四環(huán)素存在的情況下，rtTA蛋白使得基因正常表達(dá)。

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，利用常規(guī)轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是使用最廣泛的方法。雖然近年來開發(fā)了不少更為先進(jìn)的基因?qū)胼d體系統(tǒng)（如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體和piggyBac等），但常規(guī)質(zhì)?；虮磉_(dá)載體仍被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用，這主要得益于其在技術(shù)上的簡(jiǎn)便性以及在各種類型細(xì)胞中的高效轉(zhuǎn)染率。常規(guī)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵特點(diǎn)是短暫性，并且在宿主基因組中的整合效率非常低（通常小于1%）。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參考以下文獻(xiàn)。

我們的Tet-On誘導(dǎo)型基因表達(dá)載體旨在—當(dāng)缺乏四環(huán)素時(shí)，實(shí)現(xiàn)目的基因的幾乎或完全沉默；當(dāng)往體系中添加四環(huán)素時(shí)，目的基因得到快速高水平表達(dá)。我們的載體系統(tǒng)已經(jīng)過優(yōu)化，其在大腸桿菌中具有高拷貝復(fù)制能力，且對(duì)細(xì)胞具有高效轉(zhuǎn)染率。

基因表達(dá)定時(shí)調(diào)控：只依賴rtTA的Tet-on系統(tǒng)在沒有誘導(dǎo)劑的情況下，會(huì)有明顯的泄露表達(dá)。我們的Tet-On基因表達(dá)載體可嚴(yán)格調(diào)控基因的表達(dá)，在沒有誘導(dǎo)劑的情況下可將背景泄露表達(dá)最小化，并保持該系統(tǒng)對(duì)四環(huán)素誘導(dǎo)的高靈敏度。

技術(shù)簡(jiǎn)單：常規(guī)轉(zhuǎn)染即可把質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞，相比起病毒載體需要進(jìn)行病毒包裝，過程更簡(jiǎn)單。

載體容量非常大：我們的載體總?cè)萘靠蛇_(dá)30 kb，其中質(zhì)粒骨架和Tet-On元件只占4.6 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

高水平表達(dá)：TRE啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在誘導(dǎo)狀態(tài)下高水平表達(dá)。 另外，常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞多達(dá)幾千拷貝），使外源基因能高水平表達(dá)。

載體DNA非整合型：常規(guī)質(zhì)粒在細(xì)胞里主要以游離DNA狀態(tài)存在，所以常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染也稱為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。然而，質(zhì)粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染每10²~10⁶個(gè)細(xì)胞可能會(huì)有一個(gè)細(xì)胞的基因組被整合，整合效率取決于細(xì)胞類型）。如果將攜帶了藥物抗性基因或者熒光標(biāo)記基因的載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，在經(jīng)過擴(kuò)大和傳代培養(yǎng)后，可以使用藥物篩選或細(xì)胞分選來獲得穩(wěn)定整合了該載體的細(xì)胞。

可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型受限：不同類型細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率差異很大。非分裂細(xì)胞比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞比永生化細(xì)胞系更難轉(zhuǎn)染。一些重要的細(xì)胞類型更是難以轉(zhuǎn)染，如神經(jīng)元和胰島β細(xì)胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，很少運(yùn)用到活體實(shí)驗(yàn)。

基因拷貝數(shù)在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個(gè)細(xì)胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細(xì)胞間卻有高度的差異性。在一些細(xì)胞中，質(zhì)粒拷貝數(shù)非常高，而在另外一些細(xì)胞卻是低拷貝甚至沒有。而病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)更傾向于相對(duì)均勻地把基因轉(zhuǎn)到細(xì)胞中。

TRE: Tetracycline-responsive element promoter (2nd generation). This element can be regulated by a class of transcription factors (e.g. tTA, rtTA and tTS) whose activities are dependent on tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Promoter: The promoter chosen to drive expression of the tTS/rtTA cassette.

tTS: Tetracycline-controlled transcriptional silencer. This protein binds to TRE promoter to actively suppress gene transcription only in the absence of tetracycline and its analogs (e.g. doxycycline).

T2A: Self-cleaving 2A peptide from thosea asigna virus that allows multiple proteins to be made from a polycistronic transcript containing multiple ORFs separated by T2A. The cleavage occurs through a putative “ribosomal skipping” mechanism.

rtTA: Reverse tetracycline responsive transcriptional activator M2 (2nd generation). This protein binds to TRE promoter to activate gene transcription only in the presence of tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline). It has higher sensitivity to the inducing drug and lower leaky activity in the absence of the drug compared to its predecessor.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the tTS/rtTA cassette.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.